Recombinase polymerase amplification combined with fast DNA extraction for on–spot identification of Deinagkistrodon acutus, a threatened species

Resum

En este estudio se aborda la utilización de la amplificación por recombinasa y polimerasa (RPA en su sigla en inglés) en combinación con la extracción rápida de ADN para identificar sobre el terreno a Deinagkistrodon acutus, una especie de serpiente que se encuentra en peligro de extinción debido a la sobreexplotación y la destrucción del hábitat. Con vistas a su conservación, es muy conveniente disponer de un método eficiente de identificación que permita combatir la captura y el comercio ilegales de la especie. Se capturaron 14 ejemplares de 12 especies de serpiente (incluida D. acutus) en las regiones montañosas del sureste de China. Se extrajo el ADN genómico con un método de lisis alcalina que llevó cinco minutos. Se diseñaron cebadores para la RPA, específicos de la especie, a partir de las secuencias de la región del código de barras de la subunidad I de la citocromo c oxidasa, y se estableció un sistema optimizado de análisis mediante RPA. Se comprobaron la especificidad y sensibilidad del ensayo, que se validó mediante la identificación de 10 muestras comerciales de la sustancia sin elaborar conocida como Qi She derivada de D. acutus. En condiciones de RPA optimizadas, se amplificó una banda única de 354 pb solo para D. acutus, pero no para las especies de serpiente relacionadas. El proceso se puede llevar a cabo en 30 minutos a temperatura ambiente. La identificación de la sustancia comercial sin tratar Qi She permitió validar la eficacia del sistema de análisis establecido. Al combinar el análisis mediante RPA con la extracción rápida de ADN, establecimos un método de identificación de D. acutus sobre el terreno con buena especificidad y sensibilidad. Podría convertirse en un instrumento eficiente para llevar a cabo la supervisión rigurosa de la captura y el comercio ilegales de D. acutus.